SYBR Green I 染料是一種直接與雙鏈 DNA (dsDNA) 結(jié)合的熒光染料，是熒光定量PCR 最常用的DNA結(jié)合染料。在定量 PCR中，SYBR Green I可與雙鏈DNA（dsDNA）非特異性結(jié)合后發(fā)出熒光，則可以通過檢測反應(yīng)體系中的SYBR Green I 熒光強(qiáng)度，達(dá)到檢測PCR 產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。游離狀態(tài)下，SYBR  Green I發(fā)出微弱的熒光，一旦與dsDNA結(jié)合，其熒光增加1000倍，一個反應(yīng)發(fā)出的全部熒光信號與出現(xiàn)的dsDNA量成比例，且會隨擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而增加；所以通過檢測PCR 反應(yīng)液中的熒光信號強(qiáng)度，可以對目的基因進(jìn)行準(zhǔn)確定量，同時還可以測定擴(kuò)增的目的DNA片段的熔解溫度。

使用說明：

使用時，配置PCR反應(yīng)混合液，將10000×SYBR Green I濃縮液加入到PCR反應(yīng)體系，使終濃度為0.5× （0.2×到1×之間調(diào)整）。以上操作建議在冰上進(jìn)行。

注：①  反應(yīng)液配制方法和PCR 擴(kuò)增條件請參照DNA聚合酶使用說明。

②  Realtime PCR 擴(kuò)增儀的使用方法，請參照各儀器說明書。

注意事項(xiàng)：

使用濃度對熒光PCR結(jié)果的影響

SYBR Green I的使用濃度是保證熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)成功非常關(guān)鍵的因素。如果SYBR Green I的濃度過低會使熒光信號的變化降低，這就意味著低拷貝的樣品可能無法檢出；而在高濃度時，將會抑制PCR反應(yīng)，降低PCR反應(yīng)效率。所以一般在使用SYBR Green I時應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況優(yōu)化使用濃度，反應(yīng)的終濃度為0.2×到1×之間。

鎂離子濃度的影響

提高鎂離子濃度可以降低SYBR Green I對PCR反應(yīng)的抑制作用。我們建議在用SYBR Green I進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)時，鎂離子濃度比無SYBR Green I 的普通 PCR 反應(yīng)高出0.5～3mM。